降落PCR

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尽管目前PCR技术已相当普遍和成熟,但由于PCR反应中许多条件(如Mg2+、dNTPs、引物、模板、循环中的参数等)仍然会影响实验结果,特别对于一些复杂的基因组DNA模板,普通PCR往往存在非特异性扩增,得不到理想的产物。为了解决PCR非特异性扩增的问题,Don等人于1991年发明了降落PCR(touchdown PCR,TD-PCR)技术。

技术原理

降落PCR是通过对反应体系中退火温度进行优化来提高反应的特异性,其基本原理为:根据引物的Tm值,设置一系列从高到低的退火温度,开始选择的退火温度高于估计的Tm值,每一个(或n个)循环降低1℃(或n℃)退火温度,随着循环的进行,退火温度逐渐降低至Tm值,最终低于Tm值达到一个较低的退火温度。最后以此退火温度进行10个左右的循环。

PCR反应中退火温度会对扩增结果产生影响,随着退火温度的升高,扩增特异性会变好,同时扩增效率会变低。退火温度过高会使PCR效率过低,退火温度过低则会使非特异性扩增过多。降落PCR一开始先用高温扩增,保证扩增的严谨性(在较高的退火温度下通常得到特异性扩增产物),待目的基因的丰度上升后,降低扩增的温度,提高扩增的效率。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时,特异产物会有一个几何级数的起始优势,在剩余反应中非特异的位点由于丰度低无法和特异位点竞争,从而产生单一的占主导地位的扩增产物。

降落PCR具有以下三个特点:

  • 低水平、高特异性的扩增在循环的早期开始,此时的退火温度高于“最合适”的退火温度;
  • 当退火温度在目的产物的Tm值与假阳性产物的Tm值之间时,目的产物的竞争优势更加明显;
  • 较低的退火温度能很有效地增加目的产物的产量,同时使非特异性的扩增降到最低,因为特异序列在较高退火温度时得到扩增,等退火温度降到较低时,已积累大量的特异产物,减少了特异引物与非特异序列结合的机会。

退火温度设置

通常降落PCR的退火温度范围可跨越15℃,从高于Tm值几度到低于其10℃左右,在每个温度上循环1~2个周期,然后在较低的退火温度上循环10个周期左右。

降落PCR的改进

人们为了简化实验流程,同时避免最低退火温度过低会有非特异性产物出现的可能性,将TD-PCR退火温度缩短至10个系列温度,此扩增方法称作MTD-PCR。后来人们又将MTD-PCR再次改进,将退火温度缩短至5甚至4个温度范围,并将这种方法称为SMTD-PCR。改良后的TD-PCR在每一个停留的退火温度上循环4或者5次,最后一个退火温度循环次数增加至20~30个循环,以最大可能提高其特异产物与非特异产物的比率。但改良后的TD-PCR需要从较低的退火温度开始降落,因为尽管Taq等酶耐热,但经过太长时间的高温后其活性也会下降,会由于DNA聚合酶活性丧失过多而得不到足量的PCR产物。

注意事项

  • 由于降落PCR在较早的循环中需避免低Tm值配对,在降落PCR中最好应用热启动技术。
  • 降落PCR虽然有一定的优势,但它并非万能,降落PCR只能做到“锦上添花”,即能看见主带,但是存在杂带,可以利用降落PCR进行优化,但是如果连主带也看不见,只有杂带,那么用了降落PCR也不会有很好的效果。

如果扩增后跑胶观察到许多产物带或高分子量成片产物,可采取以下措施:

  • 提高DT-PCR的最高退火温度和最低退火温度,使其范围上移;
  • 减少最低退火温度条件的循环次数;
  • 使各退火温度下的循环数增加一个,如三个循环降低1℃;
  • 用嵌套式引物重新扩增第一次PCR产物的稀释物(巢式PCR);
  • 放弃此套引物,重新设计引物扩增;

降落PCR与温度梯度PCR比较

降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化,但两者在原理上有所不同。

温度梯度PCR是指在退火温度不太明确时,为了找到最优退火温度,在一台PCR仪上同时做多管PCR,每一管放在仪器内不同列(有的是不同行)上,分别进行PCR(如50-60℃可以分6管,分别50℃,52℃,54℃,56℃,58℃,60℃),最终找到最合适的退火温度,并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。

降落PCR是为了提高反应的特异性,通过设计一系列不断降低的退火温度,在同一PCR管内进行PCR扩增,最终获得大量的特异性扩增产物。

与温度梯度PCR相比,降落PCR更有优势,因为采用梯度PCR选择合适的退火温度时需要多次反应或多管反应,并且即使通过多次试验找到最佳的退火温度后,在更换其它的PCR仪进行同样的扩增时最适的退火温度也有可能发生改变,需要重新进行最佳温度的摸索。而降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果,避免了对每对引物进行最佳复性温度的优化和测定工作,并且降落PCR在很大程度上削弱了仪器性能对扩增效果的制约。

降落PCR应用

降落PCR适用于经常更换引物的实验,在不知道Tm值,同时不想很麻烦的找出最佳Tm值的情况下,使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。现在很多PCR仪具有设置降落PCR的程序,降落PCR在研究领域中已得到了广泛的应用。根据各种不同工作的需要,降落PCR还可与其它PCR方法同时使用,如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等,这些联合PCR的反应体系,所需材料均与实时定量PCR和竞争定量PCR相同,所不同的是在PCR的循环过程中使用退火温度渐低的降落PCR方法,检测PCR产物的方法与硬件也均同于实时定量PCR和竞争定量PCR。

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