大肠杆菌蛋白表达感受态细胞的制备

大肠杆菌蛋白表达SOP

本文主要讲述了大肠杆菌蛋白表达实验中感受态细胞制备实验流程和原理
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感受态细胞的概念

感受态,是指宿主细胞最容易接受外源基因并实现将其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄以及外界环境因子的影响, 比如Ca2+就可以大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

感受态细胞制备的原理

制备感受态细胞最常用的方法是用预冷的CaCl2处理对数生长期的细菌,即用低渗CaCl2溶液在低温(0℃)时处理快速生长(进入对数生长期)的细菌,从而获得感受态细胞。此时细胞膨胀成球形,外源DNA分子在低温条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细胞表面,通过热激处理促进细胞对外源DNA分子的吸收。转化效率非常高。此方法的关键在于选用的细胞必须处于对数生长期,实验操作必须在低温无菌环境下进行。

大肠杆菌感受态细胞的制备实验

1、实验仪器及试剂

  • 仪器:超净工作台,摇床,高压灭菌锅,培养箱,制冰机,超低温冰箱,离心机,接种环,试管,摇瓶(2L),平板,移液枪,枪头,离心管(500mL),EP管(1.5mL),蓝盖瓶,泡沫箱
  • 试剂:CaCl2溶液:PIPES 1.51g,CaCl2•2H2O 4.41g,甘油 75ml,pH=7.0,定容至500ml。

LB培养基(固体、液体):Tryptone 1.00g,Yeast 0.50g,NaCl 1.00g,定容至100ml。(固体培养基加入1.5%的琼脂)

抗性:卡那霉素,氨卞青霉素,氯霉素,四环素。

  • 材料:感受态菌株

2、 实验方法及操作步骤

  • 取-80℃冻存的感受态菌株,用接种环划线分离接种于固体平板上(平板抗性根据感受态选择),做好标记,倒置于37℃培养箱培养过夜。
  • 第二天,从平板上挑取单个菌落,接种至含有4ml LB培养液(抗性根据感受态选择)的试管中,37℃,195rpm,震荡培养过夜。次日取菌液4ml接种至含有400ml LB培养基(抗性根据感受态选择)的2L摇瓶中,37℃,200rpm震荡培养约2-3小时。
  • 当菌落OD600nm值达到0.3-0.5时,将摇瓶取出放置于冰上10-15min。在无菌条件下把菌液倒入500ml的预冷的离心管中,离心4℃,3000r,8min。
  • 弃去上清,加入约200ml的预冷的CaCl2溶液,吹打混匀,悬浮菌体,放入冰浴30min。
  • 离心4℃,3000r,8min,弃去上清,加入约8ml预冷的CaCl2溶液,重新悬浮菌体。
  • 将用CaCl2溶液处理后的菌体分装于1.5ml的EP管中,每管110ul,保存于-80℃的超低温冰箱中。

感受态细胞测试

随机取1支本次制备的感受态细胞,转化一个以前转化成功的质粒,从转化平板上的菌落数及表达鉴定的SDS-PAGE电泳图(看是否出现其他的杂带及蛋白表达情况)判断感受态的效价。如果效价好,这批感受可以用;否则,要重新制备。

注意事项

1、每次取感受态细胞时,注意查看库存,保证库存不低于15支,少于15支时要及时制备。

1、菌株生长在对数时进行CaCl2处理。

2、全程操作要【低温无菌】。

3、用CaCl2溶液悬浮菌体时要均匀,不要有块状。

4、常用感受态细胞的选择抗性:BL21(DE3)无抗性;BL21 Codon plus(DE3)具有氯霉素抗性;OrigamiB(DE3)具有卡那霉素抗性,不能用于具有卡那霉素抗性质粒的表达;BL21(DE3)plysS具有氯霉素抗性;Rosetta(DE3具有氯霉素抗性;Shuffle具有链霉素抗性或不用抗性。

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